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MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

Tema 13

Métodos generales de análisis microbiológico de los alimentos. III

Detección de microorganismos índices e indicadores.

Detección de enterobacterias: principios, aspectos prácticos, metodología. Detección de Escherichia coli y coliformes: principios, metodología. Estreptococos del grupo D de Lancefield: principios, metodología. Estreptococos del grupo Mitis-Salivarius. Detección de Bacillaceae.

 

DETECCION DE ENTEROBACTERIACEAS

Principios generales: El empleo de las enterobacterias (coliformes y no coliformes) como microorganismos indicadores se basa en que estas bacterias son destruidas por los tratamientos de pasteurización, térmicos o clorado de las aguas con gran facilidad. Por esto, la presencia de altos valores de enterobacteriáceas en los alimentos es síntoma de fallos en el proceso de elaboración o de conservación que pueden acarrear riesgos para el consumidor.

Su empleo como indicadores es preferible al simple análisis de coliformes (bacterias lactosa positivas) porque la frecuencia de estos últimos puede ser menor, su determinación incierta (caso de cepas de Escherichia coli fermentadoras lentas o caso de cepas no fermentadoras en Enterobacter) y a la menor sensibilidad de las pruebas para coliformes.

Para cada alimento se puede determinar un factor denominado e :

e = (ufc/gr de enterobacterias)/(ufc/gr de grupo de interés)

donde ufc/gr indica el número de unidades formadoras de colonias (bacterias viables) de cada uno de los dos grupos. De esta forma se puede calcular el e ca (coli-aerogenes) y el e s (Salmonella). Este valor es variable entre 1 y 106 dependiendo del tipo de microorganismo y del alimento en cuestión.

Aspectos prácticos: El desarrollo de métodos específicos para la detección de enterobacteriáceas totales puede ser una buena estrategia en función de la relación coste/beneficio. Esta detección puede ser la única que se lleve a cabo en regiones con pocos recursos analíticos.

Siempre que sea posible hay que completar el estudio con el análisis específico de enteropatógenos y hay que valorar los riesgos de la presencia de "falsos positivos" (altos valores de enterobacteriáceas sin presencia de enteropatógenos, lo que apoya su utilización como indicadores en vez de como índices) y de "falsos negativos" ( presencia de Salmonella spp. cuando los valores de enterobacteriáceas son bajos).

Este último riesgo puede calcularse en función del valor de e s determinado para cada alimento. Cuando los recuentos de enterobacteriáceas son altos y el valor de e s también lo es (>104 el cálculo del riesgo es inmediato. Los problemas surgen cuando los valores de e s son bajos, más aún si los valores de enterobacteriáceas también lo son. En estos casos es necesario hacer recuentos adicionales de patógenos intestinales porque el riesgo de su presencia puede ser mayor e inaceptable.

En la mayoría de los casos estudiados se ha comprobado que el recuento de enterobacteriáceas supone una garantía suficiente para el consumidor.; en cualquier caso, los resultados son más fiables que cuando se utilizan como indicadores sólo los recuentos de coliformes porque éstos últimos suelen ser más bajos y, por lo tanto, más sujetos a error.

Metodología: Los métodos generales son el uso del Agar con Cristal Violeta, Rojo Neutro, Bilis y Glucosa como medio selectivo y, como medio de enriquecimiento, Caldo tamponado con Cristal Violeta, Bilis y Glucosa. En estos medios, la Bilis supone el agente selectivo principal ayudado por el colorante Cristal Violeta; el rojo neutro es indicador de pH para detectar la fermentación.

Hay que tener en cuenta la posible presencia de organismos dañados por la situación biológica del alimento (baja aw, bajo pH), por las condiciones desfavorables de almacenamiento (caso de microorganismos no esporulantes, frío, congelación) o por el tratamiento por calor.

Hay que distinguir tres niveles de identificación: Fase de presunción o probabilidad (detección de microorganismos que crecen en Agar-Cristal-Violeta-Rojo-Neutro-Bilis-Glucosa o microorganismos productores de gas en caldo con Verde Brillante); Fase de confirmación (detección de microorganismos con respuesta positiva en medio de MacConkey); y , Fase de determinación (pruebas finales de fermentación de la glucosa y prueba de la oxidasa).

DETECCION DE Escherichia coli Y DE COLIFORMES

Principios generales: Del origen fecal de esta bacteria se concluye que su presencia en un alimento indica que éste ha tenido contacto con, y por tanto está contaminado por, materia de origen fecal. La supervivencia de estas bacterias en medios no entéricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminación reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo índice ideal para la detección de contaminaciones recientes.

La identificación del grupo coli-aerogenes se hace mediante la detección de microorganismos capaces de fermentar lactosa a 42º en presencia de un 2% de bilis y de cristal violeta.

En alimentos tratados también conviene comprobar la presencia de coli-aerogenes mediante la producción de gas en verde brillante con 2% de lactosa, aunque esto no indica claramente contaminación fecal debido a los múltiples orígenes de las bacterias de este grupo.

No es recomendable el uso del concepto de «coliformes fecales» definido por las que crecen en presencia de sales biliares a 40-42º porque el grupo no está definido taxonómicamente y las diferencias experimentales en los procesos de detección son muy críticas.

Metodología: El método es sencillo: incubación en medio de MacConkey a 44ºC en anaerobiosis. Análisis de las colonias positivas para detección de la producción de gas en medio con lactosa y de indol en medio con triptófano, ambas determinaciones a 44ºC.

Cuando los números de bacterias del grupo son del orden de 1 cfu/ml ó 1 cfu/10 gr de material el método empleado es el descrito. Si el número es inferior se realiza un análisis del número más probable y un enriquecimiento con caldo lactosado con verde brillante analizándose posteriormente los tubos positivos en medio de MacConkey.

Las bacterias de este grupo pueden entrar en un proceso de autoesterilización debida a la producción de ácidos en sus procesos de fermentación, ácidos que terminan por matarlas. Por ello es necesario utilizar medios tamponados.

En muchos casos es necesario hacer un tratamiento de recuperación de los microorganismos dañados en los procesos de preparación del alimento.

E. coli es un buen índice mientras que las coliformes en general sólo son buenos índices si los números son inaceptablemente altos. Esto es debido a que el origen de E. coli es únicamente intestinal, mientras que las coliformes pueden tener muchos otros orígenes.

La detección de E. coli es muy importante en el análisis de aquellos alimentos compuestos en los que el tratamiento de cada una de las partes haya sido diferente.

ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO D DE LANCEFIELD

Principios: Los estreptococos del grupo D de Lancefield son microorganismos Gram-positivos de origen entérico. El grupo está formado por enterococos (Streptococcus faecalis y S. faecium) y por S. bovis y S. equinus. Todos los estreptococos de este grupo se encuentran en las heces.

Son microorganismos muy resistentes a los tratamientos térmicos, de congelación o de desecación, y a tratamientos con detergentes y desinfectantes. Su supervivencia en ambientes libres es muy alta. Por todo ello no pueden usarse como índicadores de contaminación fecal reciente, aunque son útiles en el análisis de alimentos tratados térmicamente y que tienen una baja actividad de agua. También son útiles para determinar la eficacia de los sistemas de desinfección y de limpieza.

Los estreptococos del grupo D de Lancefield pueden usarse como índices de patógenos entéricos muy resistentes, como puede ser el virus de la hepatitis A.

Metodología: su detección se basa en su metabolismo fermentativo: carecen de cadena respiratoria y, por lo tanto, son insensibles a la azida sódica. Los medios de cultivo se basan en el empleo de inhibidores de la flora acompañante (azida sódica o sales biliares en altas concentraciones); como agente indicador se utiliza la esculina.

Los alimentos de origen animal o vegetal obtenidos por fermentación pueden tener unos contenidos muy altos en estreptococos del grupo D que están presentes como flora natural. En cualquier caso, números excesivamente altos de estos microorganismos pueden causar problemas toxicológicos porque son productores de aminas vasopresoras.

ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO Mitis-Salivarius

Estos microorganismos corresponden al grupo de indicadores de contaminación por contenido del tracto buco-faríngeo. Es importante su determinación en aquellos alimentos preparados para colectividades (empresas de catering, grandes restaurantes).

El método de detección se basa en el empleo de agar nutritivo tamponado que contenga telurito, sacarosa, azul tripán y cristal violeta. La incubación se realiza a 37ºC. En este medio de cultivo las bacterias de este grupo forman colonias de color azul pálido o azul, y las de otros estreptococos de color azul oscuro o negro.

DETECCION DE Bacillaceae

Prueba para evaluar la contaminación post-tratamiento: En un alimento tratado térmicamente de forma adecuada las únicas bacterias que pueden, en la práctica, estar presentes son las que hayan sobrevivido el tratamiento en forma de esporas. Por esto, el recuento de viables ha de ser el mismo cuando se hace de forma estándar que cuando se hace sometiendo previamente la muestra a un tratamiento equivalente al de esterilización (80ºc, 1 min). Cuando se realiza la medida de esta manera y se observan diferencias éstas son debidas a contaminación post-tratamiento ya que el tratamiento a 80ºC durante 1 min. elimina todas las formas vegetativas sin dañar las esporas más termosensibles, y activa, simultáneamente, la germinación de las esporas presentes en el alimento.

Esporas de termorresistencia elevada: hay esporas que son muy termorresistentes y que pueden sobrevivir en conservas appertizadas. Para detectarlas se realiza una dilución de la muestra en un caldo de infusión de cerebro y corazón y se la somete a un tratamiento de 120ºC durante cuatro minutos. Las colonias supervivientes se recuentan tras una incubación a 50ºC.

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