A la hora de desarrollar un proceso industrial destinado a la producción de un metabolito secundario o de una enzima de origen microbiano, hay que considerar varios aspectos: (1º) el aislamiento del microorganismos de interés, la detección de los metabolitos secundarios deseados y la conservación del microorganismo aislado para la producción industrial estable, (2º) el diseño del proceso de fermentación, y (3º) la mejora de las cepas aisladas para incrementar el rendimiento.

Todos los organismos producen metabolitos primarios (aquellos que intervienen en las rutas centrales del metabolismo y que son esenciales para la supervivencia y, en general, idénticos en todo tipo de organismos) y secundarios. Estos últimos son específicos de cada tipo de organismo y están involucrados en el establecimiento de las relaciones ecológicas del organismo productor.

2.1.- Aislamiento de cultivos

El primer paso en el proceso industrial es el aislamiento de un microorganismo que produzca un metabolito secundario con interés industrial. La tarea de aislamiento de microorganismos hay que plantearla considerando las características del producto y del proceso que se va a realizar y las características ecológicas de la muestra que se toma. Lo primero nos indicará dónde tomar las muestras y lo segundo cómo diseñar los medios de aislamiento para los microorganismos presentes en dichas muestras.

El estudio ecológico de las características del microorganismo de interés permitirá hacer una búsqueda sistemática en los diferentes nichos de un ecosistema, lo que proporcionará un gran número de microorganismos de salida para el proceso de detección.

Un esquema de estudio ecológico previo a la toma de muestras comprendería los siguientes pasos: (1º) lista de grupos de microorganismos que van a ser aislados (los medios y técnicas de cultivo son diferentes para bacterias y hongos, por ejemplo); (2º) descripción del ecosistema o hábitat en el que se van a tomar las muestras, (3º) agrupación de las muestras según el material de origen (suelo y horizontes del suelo, agua, material vegetal, etc.); (4º) lista de los parámetros ambientales a considerar (pH, salinidad, potencial redox, temperatura, etc.); (5º) lista de los substratos naturales disponibles por los microorganismos autóctonos en su ambiente natural, (6º) diseño de las técnicas de aislamiento usando la información de los puntos anteriores, (7º) evaluación de las técnicas de aislamiento usando patrones internos como control, y (9º) utilización de procedimientos de enriquecimiento para los microorganismos que puedan ser de interés.

1.2.- Detección de metabolitos secundarios:

Una vez recogidas las muestras hay que desarrollar el procedimiento de búsqueda y detección (screening en inglés) del metabolito secundario de interés. Históricamente la búsqueda se ha dirigido hacia la producción de antibióticos; pero actualmente se ha ampliado el campo a otros productos terapéuticos y, en general, puede desarrollarse cualquier búsqueda para la que se disponga de un sistema de detección suficientemente correcto.

En cualquier caso, haz que considerar dos cualidades importantes a la hora de diseñar un proceso de detección: (1º) la selectividad: se ha de poder detectar un compuesto de interés mezclado con un número muy elevado de compuestos que no son interesantes; y, (2º), la sensibilidad: la concentración del metabolito secundario de interés puede ser extremadamente baja.

La búsqueda puede hacerse en cultivos sólidos o en cultivos líquidos. Sin embargo, puesto que la producción ha de realizarse en cultivos líquidos y puesto que los metabolitos secundarios de cultivos sólidos son diferentes de los de cultivos líquidos, es conveniente realizar la detección, siempre que sea posible, en medios de cultivo líquido.

Las pruebas de actividad se pueden realzar sobre diferentes tipos de organismos (animales vivos, plantas, bacterias, hongos), sobre cultivos celulares o sobre preparaciones subcelulares. Para cada tipo de búsqueda hay que diseñar un procedimiento de detección adecuado.

1.3.- Desarrollo del inóculo:

Tanto en la primera producción industrial como en las siguientes es necesario utilizar grandes volúmenes de cultivo por lo que la preparación de un inóculo adecuado es una tarea de importancia capital. En un proceso industrial puede ser necesario realizar incubaciones de gran volumen (>160.000 litros) para las que son necesarios también grandes inóculos (>1.000 litros).

Para repetir rutinariamente la operación de producción es necesario utilizar cultivos almacenados del microorganismo de interés (cultivos «stock») y a partir de ellos hay que desarrollar el inóculo intentando: (1º) minimizar la pérdida de viabilidad durante el proceso de recuperación del microorganismo, (2º) obtener una copia genéticamente idéntica a la que se había almacenado (esto es: evitar mutaciones y contaminaciones), (3º) incrementar la biomasa del cultivo y (4º) cultivar el microorganismo hasta un estado fisiológico adecuado para lograr la mayor eficiencia en la fase final de producción.

Al desarrollar un inóculo es necesario conseguir una alta velocidad de crecimiento y de concentración de biomasa al inicio del proceso de fermentación.

1.4.- Mejora de las técnicas de cultivo:

Desde las primeras etapas del desarrollo de un proceso industriales hace necesario mejorar el medio de cultivo del microorganismo para conseguir un mayor rendimiento en la producción del metabolito de interés, reducir la presencia de otros productos que puedan dificultar el aislamiento del compuesto deseado y reducir los costes de producción. Puesto que el número de variables químicas y físicas independientes que afectan el crecimiento del microorganismo es muy alto, su optimización mediante el análisis sistemático de cada una de ellas se hace rápidamente imposible. Para realizar el estudio cuando hay más de cinco variables independientes se recomienda utilizar una aproximación de análisis multivariable (método de Packett-Burman) que consiste en agrupar varias variables para decidir sobre el incremento en rendimiento debido al cambio de un grupo de ellas.

1.5.- Conservación de los microorganismos importantes:

La conservación de microorganismo de interés industrial es una técnica básica en todo el proceso. La conservación ha de estar encaminada al mantenimiento de las cepas altamente productivas durante largos periodos de tiempo sin que se produzcan cambios fenotípicos, especialmente en las características relacionadas con la producción de los metabolitos secundarios de interés.

Se han desarrollado varias técnicas de conservación; (1) el subcultivo de células activas, (2) la desecación de cultivos, (3) la liofilización, (4) la congelación mecánica (-20 ó -80ºC) y (5) la ultracongelación en vapor de nitrógeno líquido (-156ºC) o en nitrógeno líquido (-196ºC). Generalmente, las tasas de supervivencia son más elevadas después de la conservación en nitrógeno líquido que tras cualquiera de los otros métodos. En los casos de conservación por congelación, es necesario añadir a los cultivos agentes crioprotectores (glicerol, Di-Metil-SulfOxido, DMSO).

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